液相色谱柱的使用与维护

张兰格

前　言

液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样 品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各 种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以
固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关 键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响 目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程 中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护
色谱柱的知识非常必要。 色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压 力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致 鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有:

(1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子 表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双 分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在 流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟 基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基 对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱 效下降,峰形出现拖尾、变宽。

(2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度 多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金 属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使 其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和 大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧 化,影响其分离效果。

(3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。

(4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有 时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如果 没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将 柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。

(5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使 色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色 谱柱的损伤,影响分离效果。

2 　色谱柱的使用

新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。 认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最 佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时 分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析 样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂 清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈 中,可用10～20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3～0. 5mL/ min , 10～15min 后可慢慢加快。
硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需 要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇 冲洗,流速0. 1～0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净 后,再用流动相平衡。
实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流 动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间 使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相 平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。

3 　色谱柱的清洗与保存

色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品 分子残留在柱子、接头、流通池中,会污染系统,影响 对其它样品的分析,降低柱效。因此分析工作结束 后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用 90 %甲醇冲洗30～60min ,若含酸、碱、盐类物质,则 要先用10 %甲醇或乙腈,或用与分析用流动相相同 的比例把含酸、碱、盐溶液换成水,冲洗30～60min , 再用50～70 %甲醇或乙腈冲洗,最后用100 %甲醇 或乙腈冲洗。若有四元泵,可用梯度达到90 %的甲 醇冲洗。直接用纯甲醇或乙腈冲洗,会导致磷酸盐 沉淀于柱子或检测池中。最好也不要用100 %纯水 冲洗柱子。纯水极性很强,ODS 填料的硅烷键是非 极性的,在纯水中各键合基团会因疏水而改变性能, 使柱效很快降低。目前已有公司推出可以使用 100 %纯水的柱子,原理是键合基团互相之间有排斥 力,阻止了键合基团性能的改变。能否用纯水冲洗 要看柱子说明书的规定。 有机相(如甲醇、乙腈) - 水体系流动相能完成 大部分析工作,但是有时分析弱酸或弱碱化合物时(如生物碱) ,为消除拖尾现象,需用离子对试剂。常 用的离子对试剂有庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠, 这时常采用p H3～5 的缓冲盐体系。离子对色谱分 离结束后,柱子应先用有机溶剂- 水体系冲洗,再用 水冲洗,最后用有机溶剂冲洗。假设流动相是甲醇- 0. 5 %庚烷磺酸钠(p H3. 3) (VnV = 50n50) ,应先 用50 %的甲醇水冲洗,然后用水冲洗,最后用甲醇 冲洗。这是因为十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠都是表面活性剂,可以洗掉脂肪油(如烷烃及其衍生物) 。 如果先用水冲洗,十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠会 将ODS 柱胶表面键合的长链烷烃洗脱下来,造成固 定相的损失。如果先用有机相- 水体系冲洗柱子, 由于表面活性剂在有机相中有一定的溶解度,并且 流动相的量比较大,会命名表面活性剂逐渐溶解在 流动相中被冲洗出来,从而减少表面活性剂对键合 相的洗脱。十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠冲洗干净后,可以再用水冲洗,然后用有机相冲洗和保存。不 同型号色谱柱冲洗所用溶剂体积见表1 。
表1 　色谱柱冲洗溶剂体积
色谱柱尺寸(mm)   柱体积(mL)  溶剂体积(mL)
125 ×4              1. 6         30
250 ×4              3. 2         60
250 ×10             20          400

色谱柱一般用流动相中所含的有机溶剂来清洗 与暂时保存,若长期不用,要用色谱柱说明书中推荐 的溶剂保存。如反相色谱柱可用纯甲醇或乙腈保 存,正相柱用烃类溶剂保存,离子交换柱用水或甲 醇/ 水保存。

色谱柱的再生

若色谱柱柱效严重下降,分离效果变差,可以用10 %异丙醇甲醇冲洗色谱柱。若柱效仍无改善,可 以对色谱柱进行再生。色谱柱再生时,最好使用廉 价的泵,而不使用高效液相色谱仪上的泵。

再生的关键是了解污染物的性质,并找到合适 的溶剂将其去除。如果污染是因强保留物质的累积 引起的,可以用流动相中较强的溶剂(90 %～100 %) 以相当于20 个柱体积的溶剂量清洗污染物。残留 的脂质能用非水溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃清洗。 如果使用的是缓冲液系统,则要先用无缓冲流动相 (即把缓冲液换成水) 以相当于5～10 个柱体积的量 冲洗,再更换强溶剂继续冲洗。但有时强溶剂也无 法将残留在色谱柱上的污染物洗掉,需要使用更强 的溶剂或者多种溶剂清洗柱子。对于含蛋白质类的 污染物,用0. 05mol/ L 稀硫酸冲洗非常有效,流速0. 5mL/ min 。溶剂与溶剂之间的组合有很多,有时 生产厂家会推荐溶剂系统。清洗、再生所用的系列 溶剂都是强度逐渐增加的,通常最后一个溶剂是疏 水的(如醋酸乙酯甚至是烃) ,可以用来溶解非极性 物质,如脂质和油类。清洗过程中必须保证冲洗溶 剂之间的互溶性,清洗过程结束时,必须借助中等强 度能互溶的中间溶剂回到初始溶剂系统。异丙醇是 一种非常好的中间过渡溶剂,既能与正己烷或二氯甲烷互溶,又能与水相溶剂互溶。但异丙醇粘度非 常大,必须在较低的流速下使用,以免泵压过高。一 般情况下,极性固定相(如Si , NH2 , Diol 基色谱填料) 的再生可以依次使用20～30 倍色谱柱体积的正已烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇冲洗色谱柱(因异丙醇 的粘度较大,冲洗过程中随时注意调整冲洗流速) , 然后再以相反的溶剂顺序冲洗色谱柱。非极性固定相(如反相色谱填料C18 ,C18 ,CN 等) 的再生可依 次用20～30 倍柱体积的甲醇:水= 10:90 (V/ V) 、 乙腈、异丙醇冲洗色谱柱,然后再以相反顺序冲洗色 谱柱。键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。例如,典型的硅胶键合柱,在没有缓冲溶液的 情况下,可以用甲醇、乙晴n 异丙醇= 75n25 (V/ V) 、异丙醇、二氯甲烷、正己烷依次冲洗。用二氯甲 烷或正己烷中洗后,考虑到溶剂相容性,柱子必须再 用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果柱子被严重污染,可以用二甲基亚砜(DMSO) 或者二 甲基甲酰铵和水按50:50 的比例混合,用低于0. 5 mL/ min 的流速冲洗色谱柱。对N H2 改性的色谱 柱进行再生时,由于N H2 可能以铵根离子的形式存 在,因此应该在用水冲洗后用0. 1mol/ L 的氨水冲 洗,然后再用水冲洗,直至碱溶液完全流出。 另外,大多数强保留污染物都会累积在柱头上, 对柱子反冲可以缩短冲洗时间。当然还要看所用色 谱柱是否允许反冲。无论正冲还是反冲,最好不要 接检测器,以免污染物进入检测池。 污染物的过多累积会加大清洗难度,清洗柱子频率越高越容易清洗,所以有规律地清洗柱子,可以 预防重大问题的发生。 污染严重的色谱柱冲洗无效时,需将柱内填料 取出进行处理,或更换新填料。还可以将柱头入口 处被污染的填料取出,重新补装同类型的填料,然后再改变柱流向进行再生。这种逆流再生方法,可以使大多数柱子性能得到恢复。

5 　色谱柱的维护

色谱柱使用过程中不能碰撞、弯曲或强烈震动。当柱子和色谱仪连结时,阀件或管路一定要清洗干 净。以下从流动相、样品、保护柱等方面提出色谱柱 维护应注意的一些问题。

(1) 流动相: 流动相使用前必须经脱气和过滤处理。即使仪器配有自动脱气机,也最好采用超声 脱气或其它简便的脱气方法对流动相进行预脱气。尽量避免使用高粘度溶剂(如异丙醇) 作为流动相, 避免流动相组成及极性的剧烈变化。流动相应尽量 使用色谱纯,减少流动相中杂质对色谱柱的污染和 对检测器的影响。水用超纯水, 流动相最好用 0. 45μm或0. 22μm 的膜过滤。大多数反相色谱柱 的p H 稳定范围是2～7. 5 ,硅胶柱p H > 8 时会发生 硅胶溶脱,键合型柱p H < 2 时会发生键合相断裂, 流动相尽量不超过色谱柱的p H 范围。普通C18 柱 尽量避免在40 ℃以上的温度下分析。柱内不溶物 容易引起色谱柱的堵塞,影响样品的分离。不溶物 产生的原因是有溶剂的不互溶、样品溶解液和流动 相不互溶或者由于温度改变或固定相干涸而产生沉 淀。为避免上述问题,要注意溶剂之间的互溶性。若两种溶剂不互溶,需经过中间溶剂慢慢过渡。保 存时应将色谱柱两端密封,并尽量保持室温恒定。

(2) 样品: 对内径5μm 的柱子, 样品需经 0. 45μm的膜过滤,更细的柱子要0. 22μm 的膜过 滤。基体比较复杂的样品需经过一定的样品预处 理,例如海洋沉积物、中药提取液、体液等,需要采用 萃取等方法除去对柱子有损坏的较大杂质,例如色素、多糖、蛋白质等。尽量减少进样量,避免过载。

(3) 保护柱:最好使用预柱作为保护柱,减少污 染物对分析柱的损伤。压力升高通常是需要更换预柱的信号